迎接蛋白組學樣品處理新挑戰 Empore StageTips助力高通量檢測

蛋白組學的實驗過程高度依賴優化的樣品前處理。其中，蛋白消解和質譜分析這兩步之間的處理過程對整體分析質量和靈敏度有著非常重要的影響。一種名為StageTips的關鍵技術于2003年由南丹麥大學蛋白質組學領域著名學者Matthias Mann報道，并因其高效和簡便而在蛋白組學研究中得到廣泛使用。許多研究機構根據自身課題特點開發了StageTips的應用規程。

StageTips是一種填充了Empore膜片的微量移液管。其全稱是“Stop and go extraction tips”，喻意為蛋白分解產生的肽被Empore膜片攔截，然后由適當的溶劑釋放出來。這個過程中，鹽份去除，肽得到純化和濃縮，或者預分餾。Empore膜片由高分子纖維網固定住的功能顆粒構成，同時具有很好的物理特性（如柔軟、致密）和化學特性（如高保留因子），使StageTips特別適用于LC/MS分析之前處理肽溶液樣品。膜片中功能顆粒種類的多樣性使StageTips具有多種不同性能，可以根據應用內容有多種選擇，并可以在一支StageTips中組合使用。

a - 單層Empore膜片的StageTips（放大圖中為Empore膜片材料結構示意）; b – 多層膜片的StageTips ；

圖1 StageTips外觀

Empore相對于用松散顆粒制成的產品有多種優勢，包括：顆粒填充致密無溝流；無需篩板；洗脫體積小；容量可由增加膜片層數而擴大。

圖2.  Empore StageTips 質量控制：這些數據顯示SDB-RPS StageTips 在不同批次和同一批次內測試結果的良好可重復性和可靠性，證實生產工藝的*性。

應用實例一：美國著名醫院Mayo Clinic 于2020 開發了基于StageTips和臨床質譜的 疫情快速診斷方案，可以達到和PCR相似的精度。

圖3. Mayo Clinics疫情高通量檢測方案：基于StageTips 和OrbiTrap LC-MS。

應用實例二：高通量磷酸化蛋白質組學檢測

DNA轉錄成mRNA要再翻譯成具有特定氨基酸序列的蛋白質才能在體內發揮功能，其中大部分蛋白質往往還需要經過化學修飾才能具備真正的活性，這種修飾稱為翻譯后修飾（PTM）。翻譯修飾的過程，就是在蛋白質氨基酸序列中添加特定氨基酸或改變特定化學官能團的過程，進而改變蛋白質的結構。已有實驗證明有三百多種潛在的PTM類型，并且同一個蛋白質可能在多個位點發生修飾，這就促成了蛋白結構和功能上的多樣性。在眾多的PTM類型中，磷酸化修飾（Phosphorylation modification）的蛋白占到了所有蛋白質約三分之一，是普遍的修飾類型之一。會影響到細胞內信號轉導、細胞結構、細胞增殖、凋亡、轉錄、代謝過程以及調控病原微生物的適應能力等等，所以在不同細胞中，蛋白磷酸化水平會呈現不同的差異，特定位點的磷酸化程度可能從小于1%到大于90%。

圖 4. StageTips 用于高通量磷酸化蛋白質組學檢測

磷酸化蛋白質組學是研究這個蛋白質磷酸化修飾的重要方法之一。如圖四所示，通過采用基于StageTips的高通量蛋白質組學樣品制備方法，相對于傳統樣品制備方法來說，所需要的檢測樣品少了10倍，檢測時間減少3倍，但定量化磷酸化位點增加了3倍，極大了提高了研究效率。

高堿性條件下的分餾可大大提高蛋白質檢出率。相比于傳統的方法，比如離線HPLC 泵，或者散裝填料裝的Tips，Empore C18 Stage Tips 更為高效，同時成本更低。圖五顯示的數據表明通過StageTips 在高堿性條件下的分餾樣品處理，蛋白質檢出量增加了50%，同時蛋白質覆蓋率提高了10%。

圖5: HeLa細胞系用 Empore C18 StageTips在高堿性條件下進行分餾處理可大大增加蛋白質和多肽的檢出水平。

Empore還具有自身優勢，其中可供選擇的功能顆粒和應用如下表所示。

【附帶說明：】Empore原本由3M公司生產。2019年，萊伯泰科公司從3M公司收購了Empore的生產線，由旗下CDS公司全面掌握生產工藝并生產和銷售。許多將Empore作為關鍵材料的高科技產品得以繼續生產。